84分Nature顶级子刊重磅综述外泌体

阿波没有罗
2022-04-17
细胞外囊泡在近年较为火热,它不仅可以作为生物标志物,对于疾病治疗也有很大作用。这次就让我们从这篇最近发表的高分综述(IF=84.694)中重新回顾一下细胞外囊泡与疾病的关联及其作为治疗的新策略。希望可以对你有所启发。



摘要


细胞外囊泡(EV)研究领域在过去十年中迅速发展,从基础生物学研究发展为具有重要临床意义的学科。现在正在认识到利用EV诊断和治疗疾病(包括癌症、神经和心血管疾病)的潜力。因此,正在积极探索EV作为治疗靶点、生物标志物、新型药物递送剂和独立疗法的应用。本综述简要概述了各类EV的特征和生理功能,重点介绍了它们与疾病的关联以及用于治疗开发的新兴策略。


简介


细胞外囊泡(EV)是细胞释放到细胞外空间的膜衍生囊泡,在细胞间通讯中发挥重要作用,参与调节一系列生物过程。在过去的十年中,人们对EV的类别和特征及其生理和病理作用的认识迅速增长。

剖析EV的生物发生过程揭示了几个不同的类别,它们是通过内体途径或非内体途径产生的。EV由原核细胞和真核细胞分泌,但对真核细胞产生的细胞进行了更深入的研究。迄今为止研究的所有哺乳动物细胞类型——包括神经元细胞、内皮细胞、间充质干细胞(MSCs)和上皮细胞——都被发现可以释放EV。EV也可以在血液、滑液、尿液和唾液等生物体液中找到。

EV的主要类别是凋亡小体、微泡和外泌体(图1)。

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图1. EV的类别、生物发生、特征和分离方法。

然而,很难对正在研究的EV类型进行有把握的分类,因为它们可以在分泌前用各种生物发生途径共有的标记进行修饰。然而,EV的特点是大小和同质化程度,这取决于分离方法。所有EV都被脂质双层包围,它们的直径范围从50 nm到2,000 nm,具体取决于它们的生成方式。

国际细胞外囊泡协会(ISEV)已发布指南,以帮助研究人员表征EV并确定其EV制剂的纯度。MISEV2018建议EV研究人员考虑使用指示EV物理特性的命名法,例如尺寸(可将小型EV设定为直径<100 nm或<200 nm的EV,将直径>200 nm称为中/大型EV)、密度、某些生化成分的存在(例如CD63+EV)或来源的条件或细胞(例如脑源性EV)。其他研究应确定正在研究的EV的功能,应使用诱导剂和分泌抑制剂等工具来区分可能的EV类别或将它们与非EV产品进行比较。本篇综述中使用的EV命名法基于MISEV2018的指南。在缺乏EV特征或所研究的EV类型的不确定证据的情况下,使用通用术语EV。


EV可以在正常生理条件下以及在病理过程中释放。虽然早期研究的重点是了解不同类别EV的生物发生,但最近的研究调查了EV在癌症、神经退行性疾病和心血管疾病等各种疾病的病理学中的作用。EV的病理能力是从它们的特定内容物中获得的,这些内容物是从起源细胞中包装出来的,代表了亲本细胞的状态。例如,EV与阿尔茨海默病(AD)中的淀粉样蛋白-β(Aβ)等神经毒性蛋白和病毒等感染因子的传播有关。EV越来越多地被认为是许多疾病的贡献者,它们既可用于研究病理学,也可用作诊断生物标志物。几项研究旨在针对EV,例如通过使用可以阻止EV释放或阻止其被邻近细胞吸收的抑制剂。

EV研究最近的一个重点是利用它们作为治疗分子的靶向递送载体,例如小化合物、蛋白质和小干扰RNA(siRNA)。最广泛使用的EV应用是由发现MSC衍生的EV对心血管疾病和癌症的治疗有益,并且可能比亲本MSC或其分泌组更有效。公司已经生产了旨在封装治疗剂的外泌体,或者已经使用遗传方法编程以靶向特定组织和细胞类型的外泌体。

本综述概述了EV的生理和病理作用,重点关注癌症、神经退行性疾病和心血管疾病。讨论了EV在治疗上的新兴潜力——作为靶点、治疗剂、药物输送工具和生物标志物——同时考虑了相关的挑战和限制。


EV的类别和生物发生


EV分为三种生物型,即外泌体、微泡和凋亡小体,由它们的生物发生决定。然而,本综述使用通用术语EV,除非讨论的研究使用概述的方法描述了它们的EV制备。ISEV定义EV的最低实验要求。

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外泌体


小型EV的直径为50-150nm,可以包含异质的“经典”或“非经典”外泌体群。源自内体途径的经典外泌体通过晚期内体膜向内内陷形成多泡体(MVB)(图1)。

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转运所需的内体分选复合物(ESCRT)蛋白,包括ESCRT-0(肝细胞受体酪氨酸激酶底物(HRS);也称为VPS27)、ESCRT-I(肿瘤易感基因101(TSG101))、ESCRT-II(VPS25)和ESCRT-III(CHMP4A、CHMP4B和CHMP4C)参与募集内容为并形成晚期内体膜的内陷。ESCRT-0、ESCRT-I和ESCRT-II负责识别泛素化的内容物并将其加载到内体的管腔中。ESCRT-II蛋白激活ESCRT-III的组装,其募集辅助蛋白,如ALG-2相互作用蛋白X(ALIX)和VPS4,以协调MVB中腔内囊泡(ILV)的形成。不依赖ESCRT的途径还可以通过鞘磷脂酶水解和中性鞘磷脂酶2(nSmase2)形成的神经酰胺介导MVB的向内出芽。神经酰胺诱导MVB膜的自发负曲率形成ILV。然后MVB与细胞膜融合并将ILV(现在定义为外泌体或“外泌体样囊泡”)释放到细胞外空间。

RAS相关蛋白RAB27A(RAB27A)和RAB27B都是质膜外泌体分泌所必需的。在MVB中形成期间,ILV可以包装内体蛋白、细胞溶质蛋白以及反映其亲代细胞的特定蛋白质和基因组内容物。诸如CD63之类的四跨膜蛋白在引导EV内容物方面发挥着作用,因为它们参与了质膜和几个细胞器之间的回收途径。

小型EV通常在去除凋亡小体和微泡后通过100,000g超速离心分离。它们可以使用速率区域离心进一步纯化,以通过Optiprep梯度解决小囊泡。已发现小型EV富含四跨膜蛋白(CD63、CD9和CD81)、膜转运蛋白(RAB蛋白和膜联蛋白)和参与MVB形成的蛋白(ALIX、TSG101和网格蛋白)。蛋白质分选机制的成分,例如与ESCRT途径相关的成分,也可以在EV制剂中检测到,并可用于提高定义被分离EV亚型的信心。这些蛋白质的存在有助于区分正在研究的EV是否可能是对经典外泌体标记(如CD63、CD9和CD81)呈阳性的小型EV,或者是不表达这些四跨膜蛋白的非经典外泌体。

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微泡


从细胞中脱落的微泡大小范围从150 nm到大于1,000 nm,平均大小为250-400 nm,可以称为大EV。微泡通过细胞膜的向外出芽产生,细胞膜分离并成为囊泡(图1)。细胞溶质生物分子的特异性胞吐作用是随机的,但膜蛋白和受体在微泡出芽之前靶向质膜。膜的出芽发生在质膜的特定位置,并受磷脂再分布以及Rho激酶介导的肌球蛋白轻链磷酸化和收缩机制的影响,以允许囊泡收缩和分离。

微泡通常以脂质组成、质膜受体和反映其细胞来源的分子为特征。微泡内容物由向质膜运输的生物分子组成,通常包含片段化的核糖体RNA(rRNA)和mRNA。通过首先去除凋亡小体,然后以10,000g离心上清液,可以从条件培养基和生物体液中分离微泡。类似大小的微泡和微粒已在细胞生物学中得到广泛研究,因为它们很容易使用透射电子显微镜(TEM)和荧光激活细胞分选(FACS)等常用方法检测到。

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凋亡小体


凋亡小体代表最大的EV类别,尺寸为1-5 μm。它们是通过细胞死亡过程中凋亡细胞膜的特征性起泡和突出产生的(图1)。

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在由正常生理信号传导或致病过程触发的程序性细胞死亡后,发生膜起泡,形成凋亡突起,即微管尖峰、凋亡和珠状凋亡。这些突起分解形成凋亡小体,包围整个细胞器、核基因组DNA、片段化的核酸和随机封闭的内容物。通常,通过巨噬细胞识别质膜标记物,然后进行吞噬作用,可以去除凋亡小体。

去除细胞碎片后,可以在2,000g–4,500g的相对较低的离心速度下沉淀凋亡小体。它们对几乎所有细胞标志物都是阳性的,包括那些与微泡和外泌体重叠的标志物,因此大小是区分凋亡小体与其他EV的重要特征。已证明凋亡小体呈递CX3C-趋化因子配体1(CX3CL1)和细胞间粘附分子3(ICAM3)以吸引吞噬细胞进行吞噬并含有大量的18S和28SrRNA,具有不同程度的降解,与微泡和外泌体相比。在TEM下,可以在大的圆形凋亡小体中观察到染色质。

细胞来源标记、分离方法和囊泡大小可用于使用体外模型从其他EV中识别凋亡小体。微泡和外泌体在生物体液中得到了很好的研究和分离,但与较小的EV相比,血液中循环的凋亡小体的相对数量尚不清楚。近年来,人们假设凋亡细胞与其他细胞交流,特别是通过凋亡小体传播致瘤性和水平DNA转移并促进炎症。


EV的生理功能概述


小型和大型EV都可以在生理条件下从正常健康细胞中释放出来,以确保细胞间通讯,从而调节从细胞维持到免疫反应的一系列生物过程。由于EV的功能已在其他地方进行了深入讨论,因此下文仅简要概述了其关键功能。应该注意的是,EV在正常生理条件下的确切作用仍然是不完全理解。这是因为缺乏生理体外和体内模型来验证EV对其他细胞通信模式的贡献以及EV群体的异质性,而EV的亚群缺乏精确的定义。

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细胞间通讯



EV在细胞间通讯中发挥着重要作用——它们在细胞之间转移腔内EV内容物,包括蛋白质、脂质和调节RNA——以维持正常生理。EV使用多种机制来介导细胞间通讯,例如直接与受体细胞的质膜融合,以实现跨膜蛋白和脂质的交换。EV和质膜之间脂质膜分布的相似性可以提供一种在机制上类似于吞噬作用的摄取途径。EV摄取机制也已被证明发生在几乎所有已知的内吞作用途径和膜融合事件中,由网格蛋白依赖性或网格蛋白非依赖性机制介导,这些机制已在其他地方进行了广泛综述。在质膜和MVB内发现的允许分泌和摄取的特定特征已全面详细说明。

由于体内循环的EV群体的异质性,解开由EV细胞间通讯介导的生理功能网络是一个挑战。该领域对用于研究EV内容物功能转移的方法提出了挑战。虽然关于EV靶向特定细胞和组织的能力仍有很多发现,但该领域已经利用了各种EV吸收机制和内容物-加载方法以利用其用于治疗用途的途径,这将在下面进一步讨论。

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组织发育和维持



在不同环境中从某些细胞类型中摄取EV可能使特定目标细胞有效地使用传入的内容物。通过将细胞表面受体(如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)包装到EV表面以捕获纤连蛋白并促进外泌体-细胞相互作用,可以促进生长因子和粘附蛋白向适当组织的传递。特定的相互作用允许功能性EV内容物的转移,这些内容物可以改变细胞外基质成分的表达以调节细胞功能,例如细胞增殖、迁移和器官形态发生。例如,在源自骨髓或基质干细胞的EV中发现的某些miRNA内容物已被证明可调节成骨细胞分化以促进成骨细胞活性和骨再生。

内皮EV在优化组织功能方面发挥着重要作用,确保它们的内容物到达特定部位以响应生理信号和刺激以维持动脉分化。有许多内皮谱系细胞依赖miRNA和蛋白质EV内容物来指导器官发育和功能。在大脑中,星形胶质细胞衍生的EV含有促进神经突生长、神经元存活和突触传递的蛋白质。

尽管过去十年主要集中在支持EV作为细胞间通讯器的关键作用的研究上,但现在有证据支持EV作为细胞垃圾袋的原始假设。去除有害细胞内容物是维持细胞稳态所需的重要生物学过程。对于病理生理环境尤其如此,例如在错误折叠的蛋白质在神经元内积聚的神经退行性疾病期间。

然而,作为生理维持的一部分,EV有助于去除有害的细胞质DNA,作为正常细胞的自卫机制。EV分泌受损的自身DNA可能与自噬介导的DNA向溶酶体的递送平衡,以供DNASE2A(一种溶酶体核酸酶)降解。随着我们对疾病系统内EV分泌和摄取的平衡行为有了更好的了解,研究人员可能会重新审视EV在生理废物清除中的作用。通过观察为治疗而设计的外源性EV内容物的非生理剂量的吸收或去除,可能会发现这一作用的一些线索。

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免疫反应



免疫系统通过发起涉及非免疫和免疫相关细胞的反应来防御病毒或细菌感染。通常,抗原呈递细胞,如树突状细胞(DC)、B细胞和巨噬细胞通过细胞表面蛋白直接与T细胞和自然杀伤(NK)细胞相互作用,以调节免疫反应。已发现由抗原呈递细胞分泌的EV表达相同的细胞表面蛋白,例如MHC1类和II类分子,并且可以充当“抗原呈递EV”。蛋白质组学研究表明,除了细胞因子、补体因子、免疫调节miRNA、免疫抑制内容物和其他活性分子,EV还可以携带促炎和抗炎受体和配体。可以使用ExoCarta数据库(http://www.exocarta.org/)挖掘抗原呈递EV的蛋白质组分析。

在内化后,miRNA和蛋白质等各种内容物可以在病毒感染期间提供保护,防止细胞凋亡,而包装在受感染EV中的其他病毒因子可以操纵宿主受体细胞以使其自身利益最大化传播。在细菌感染期间,巨噬细胞可以释放EV以潜在地允许摄取分枝杆菌mRNA并激活巨噬细胞或CD8+和CD4+T淋巴细胞以引发针对分枝杆菌感染的免疫反应。


EV和疾病


EV代表了生理细胞间通讯的重要介质,但它们也参与疾病,从功能失调的细胞中传播病理内容物。EV的分泌与癌症侵袭性、转移和疾病进展的增加相关的发现加速了对EV在疾病中作用的研究。下面将讨论EV在癌症、神经退行性疾病和心血管疾病中的新兴作用。尽管EV在其他疾病中也有作用,包括感染和自身免疫性疾病,但这些已在其他地方得到很好的综述,因此这里不讨论。

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癌症


肿瘤衍生的EV可以加速肿瘤生长并促进转移,同时操纵支持组织以创造最佳的肿瘤微环境(图2)。

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图2. EV在癌症、神经退行性疾病和心血管疾病中的作用。

过去十年提供了越来越多的证据,证明肿瘤衍生的EV含有功能性癌蛋白和致癌RNA,它们参与模拟原发性肿瘤特征的转移前生态位的产生。当它们与原发性肿瘤共享一条血管路径时,可以预测继发性转移部位,因为肿瘤衍生的EV在淋巴系统或血流内传播并进入远处器官的血管床。肿瘤衍生EV的器官向性也可以通过检测它们的整合素表达谱来预测,这可以确定它们在特定远处器官中的靶细胞。

1)EV、致癌因素和转移

转移性肿瘤的定植是一个高效的过程,其中EV起着至关重要的作用。研究肿瘤衍生的EV以了解它们的致病作用提出了各种挑战。现在越来越多的证据表明,EV的各种亚群可能会产生一系列不同的影响。潜在地,包含不同致瘤成分的EV的几个亚群可以协同工作以逃离起源部位,侵入邻近组织并建立次要部位。例如,在EV中发现的Wnt家族蛋白,特别是Wnt10b的显著增加,可以诱导上皮-间质转化以允许肿瘤侵袭。同时,含有磷酸化表皮生长因子受体(EGFR)的微泡-一种通过促进肿瘤微环境在各种癌症中发挥主要作用的生长因子-可以在抑制头颈癌中发生的膜联蛋白A后分泌组织。

此外,肿瘤来源的微泡的血管内皮生长因子(VEGF)已被证明可刺激邻近细胞中的血管生成和肿瘤生长。不同群体的EV也可能被特定细胞吸收。例如,观察到胰腺导管腺癌产生的EV优先被位于肝脏中的巨噬细胞摄取。这些由胰腺导管腺癌产生的EV的摄取提供了一个转移前的环境,该环境将骨髓来源的细胞迁移到肝脏并上调TGFβ,从而导致纤维化的激活和进一步的肿瘤负荷。

EV可能选择性地包装促进癌症的内容物的方式以及它们的内容表达如何在癌症发展中发生变化仍未解决。可能是癌细胞能够失调ESCRT通路以增加EV分泌,从而导致癌症EV分泌分子的上调。

事实上,从原发性肿瘤部位开始,EV可以通过ESCRT介导的途径协调致癌因子向非致瘤性邻近细胞的细胞间转移。原癌基因c-src(控制细胞生长、粘附和迁移)可以与ALIX相互作用以募集ESCRT介导的ILV形成并被封装到EV中,从而增加EV释放以促进肿瘤生长。ALIX的缺失已被证明会导致EV相关的程序性死亡配体1(PD-L1)减少,从而导致乳腺癌体内模型中肿瘤相关免疫抑制的减少和进一步的肿瘤生长。沉默ESCRT-III组装组分CHMP4B和VPS4A可减少β-catenin释放到EV中,从而抑制肝细胞癌的细胞迁移和转移。进一步研究ESCRT通路介导促癌蛋白包装的机制可能有助于制定治疗策略。

在支持肿瘤生长的肿瘤衍生EV中发现的致癌因子数量是压倒性的。已证明从原发性胶质母细胞瘤细胞分泌的肿瘤衍生EV(50-500纳米)被人脑微血管内皮细胞吸收并诱导血管生成,可能通过转移富含血管生成蛋白(如血管生成素、白细胞介素)的胶质母细胞瘤微泡内容物IL-6和IL-8。EV中的致癌因子还可以诱导基质细胞的增殖,从而为营养支持提供结缔组织和血管。据报道,多种肿瘤支持细胞因子如SDF1、VEGF、CCL5和TGFβ的表达在脂肪。这些细胞因子的转移触发了TGFβ受体I和II的表达,从而导致SMAD2的磷酸化和肌成纤维细胞、肿瘤相关基质细胞的分化。

EV也可以与RNA和小RNA一起包装。EV小RNA,尤其是miRNA,在受体细胞中发挥作用,它们每个都可以有许多mRNA靶标并调节多个生物学途径。例如,据报道,表现出KRAS突变的结直肠癌细胞通过摄取富含miRNA(miR-100、miR-10b、miR-320a和miR-320b)的EV来影响健康细胞,这可能反过来诱导参与细胞生长和迁移的蛋白质的表达。

在另一项研究中,发现在前列腺癌干细胞分泌的EV中高表达的miR-100-5p和miR-21-5p在与正常成纤维细胞一起培养时参与形成转移前生态位和增加迁移。此外,据报道,含有miR-21、miR-378e和miR-143的EV参与刺激乳腺癌细胞的上皮-间质转化表型。尽管需要进一步研究,但鉴定出的各种miRNA最有可能协同作用以促进上皮间质转化、增加迁移和侵袭、促进转移前的生态位并最终在癌细胞中产生侵袭性表型。

关于研究功能性mRNA,Valadi等人的里程碑式文章证明外泌体mRNA可以潜在地在受体细胞中转移和翻译。由于缺乏可靠的读出系统来跟踪EV内容物的转移和交付,因此很少有后续研究发表。

由于缺乏可靠的生物测定,许多人寻求结合体内和体外工作以及临床样本的支持证据来验证关键EV mRNA候选者的功能。使用卵巢癌原位小鼠模型发现ES-2细胞是一种高度快速转移的卵巢细胞系,可促进体内转移。在ES-2 EV中发现的关键分子是MMP1,它在卵巢癌患者的腹水中也非常丰富。对从患者腹水中分离出的含有不同MMP1表达水平的EV进行处理,会导致相关水平的半胱天冬酶活性升高,从而导致间皮细胞凋亡和潜在的癌症迁移。最近,新的细胞系统已被应用于挑战EV介导的miRNA和mRNA转移的假设。

2)EV和血脑屏障

高度转移性癌症,如肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌和肾癌,最终会扩散到通常受到血脑屏障(BBB)保护的大脑。尽管关于EV如何绕过BBB的研究很少,但由于体外建模BBB的复杂性,一些见解开始出现。与内皮细胞层一起发现的星形胶质细胞在调节BBB通透性中起主要作用并且已被证明可提供失调的星形胶质细胞EV含量以促进脑转移性癌症。PTEN是一种肿瘤抑制因子,通过转移PTEN靶向miRNA(miR-19a)在脑转移性肿瘤细胞中丢失,发现其在星形胶质细胞衍生的EV中显著上调。此外,为了进入大脑,肿瘤衍生的EV已被证明通过转移miRNA种类来分解BBB,这些miRNA种类靶向与紧密连接和肌动蛋白重塑相关的蛋白质的翻译。

发现miR-181c在来自高度转移性人乳腺肿瘤细胞的EV中升高,这导致其靶标PDPK1下调,从而导致肌动蛋白动力学重组以允许外渗。此外,miR-105下调紧密连接蛋白ZO1,并在从癌症衍生的EV递送时破坏内皮单层的屏障功能。

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神经退行性疾病


从历史上看,从突触前神经元到突触后神经元分泌的突触小泡被描述为大脑神经网络内神经元通信的主要方法。EV可以从神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞中释放出来,代表了一种通过蛋白质和基因组物质转移进行神经元内通讯的新方法(图2)。EV及其内容物从一个神经元到另一个神经元的跨突触转移可能涉及生理神经元通讯,但在神经退行性疾病的情况下,也可能涉及将病理蛋白质传播到邻近的健康神经元。此外,已在神经退行性疾病中观察到EV介导的BBB分解。

神经病理学蛋白质的错误折叠和聚集是神经退行性疾病的标志。在过去十年中,EV已被证明含有多种神经病理学蛋白,如淀粉样前体蛋白(APP)和Aβ、朊病毒蛋白(PrP)、α-突触核蛋白、SOD1和tau。传染性朊病毒(PrPSc)是一种可传播的病原体,可导致动物瘙痒病和几种家族性和散发性朊病毒病,例如人类的克雅氏病(CJD)。EV对朊病毒病的研究已引领神经退行性疾病领域研究EV在脑部疾病中的作用。朊病毒蛋白的传染性提供了一个可靠的体外和体内系统,通过利用检测受体细胞中是否存在感染的能力来研究EV在神经退行性疾病中的作用。传染性朊病毒在大脑中的传播被认为是由EV介导的,两项初步的体外研究表明,朊病毒感染系分泌的外泌体对幼稚细胞具有感染性。此外,用刺激EV释放的离子载体莫能菌素处理朊病毒感染的细胞,增加了幼稚细胞的朊病毒感染性。

随着EV研究的发展,该领域观察到一种“朊病毒样”传播,所有错误折叠形式的神经病理蛋白都存在,EV可能在将神经毒性蛋白从一个大脑区域传播到另一个大脑区域中发挥作用。根据AD和帕金森病(PD)的分期分类,随着疾病的进展,从一个相邻区域到下一个区域观察到病理扩散的模式和预测性质。从患有AD和路易体痴呆(DLB)的患者死后组织中分离出的脑源性EV被发现在小鼠颅内注射后加速磷酸化α-突触核蛋白和tau的细胞内积累。最初使用从突变tau转基因小鼠大脑中分离出的EV进行了类似的研究,在tau病小鼠模型中观察到这些EV加速了注射部位的tau过度磷酸化。目前,还没有确凿的研究表明EV是否可以在大脑内相互连接的神经元之间移动。

尽管大多数研究都集中在EV中包含的神经毒性蛋白,但少数研究调查了神经退行性疾病中失调的miRNA。大多数miRNA研究都集中在临床血清或血浆中生物标志物的开发。尽管如此,已在感染朊病毒的细胞系分泌的外泌体中发现了miRNA的谱,最近有报道称各种miRNA在AD细胞模型分泌的EV中富集。此外,一个使用良好的肌萎缩侧索硬化症(ALS)细胞模型被证明可以分泌富含miR-124的CD63+EV,这导致受体小鼠小胶质细胞中产生MMP-9等炎症介质,并有可能增强神经炎症和运动神经元变性。

miRNA谱也已在从“健康”和AD死后脑组织中分离的脑源性小型EV中得到表征。有趣的是,与对照组相比,从AD受试者分离的脑源性EV中miRNA表达的方向与在AD受试者的外周血清EV中检测到的方向相反,这表明脑生物标志物可能不存在于血液中。然而,一些“大脑特异性”miRNA种类在两种组织中都大量表达,表明它们具有作为AD生物标志物的潜在应用。从死后脑组织中分离脑源性EV的能力为进一步研究脑源性EV是否也在神经退行性疾病的病理传播中发挥作用提供了可能性。然而,在对组织衍生的EV制剂进行此类分析时,重要的是要考虑细胞死亡后释放的细胞内囊泡的潜在污染。

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心血管疾病


来自不同细胞来源(如内皮细胞、平滑肌细胞、血小板和白细胞)的EV被释放并在血液中循环,在那里它们可能导致动脉粥样硬化和心血管疾病等外周疾病(图2)。动脉粥样硬化是一种由于脂质和胆固醇形成的斑块积聚而导致动脉变窄的疾病。通常,动脉粥样硬化发生在心血管疾病的初始阶段,导致动脉粥样硬化病变、内皮细胞功能障碍、收缩心肌丧失和心肌梗塞,这可能是严重的或被证明是致命的。正如所讨论的,EV,特别是微泡或大型EV已被证明在动脉粥样硬化病变的发生和进展中起作用。然而,它们现在正被用于提供潜在的心脏再生疗法。

抗动脉粥样硬化区域经历微泡样囊泡的生理起泡(90-400 nm),这维持了质膜上磷脂的平衡分布。在动脉粥样硬化易发区域,由于细胞死亡,会发生微泡或更大的EV脱落,这会导致磷脂失衡和平滑肌细胞的改变。来自缺氧心肌细胞的EV含有凋亡因子,如HSP60和TNF,它们会引发细胞死亡,并且在摄取后对受体心肌细胞有害。为了进一步加剧血管损伤,来自血小板和白细胞的EV提供促炎和抗炎细胞因子,如TNF、IL-6、IL-8和IL-1β来刺激炎症,导致内皮功能失调。此外,EV通过上调ICAM1、VCAM1和E-selectin等粘附分子促进单核细胞与内皮细胞的粘附。单核细胞向病灶的募集进一步诱导细胞凋亡和EV额外释放到动脉粥样硬化斑块中,导致潜在的斑块破裂。

新发现引发了对心肌梗死后利用基于MSC的治疗促进血管生成和恢复心脏功能的潜力的研究。然而,基于MSC的治疗的重点已经转移到使用MSC衍生的EV,因为它们被发现含有丰富的内容,可以刺激内皮细胞的迁移和血管生成。例如,来自人骨髓来源的MSC的EV下调了白细胞与内皮细胞的粘附,这可能用于最大限度地减少内皮的进一步损伤。
同样,内皮细胞衍生的EV,例如来自人类微血管内皮细胞的EV,被发现会分泌含有miR-214的EV,从而刺激邻近靶细胞中的血管生成。其他发现富含内皮细胞衍生EV的miRNA已被证明可靶向抗炎和抗血管生成基因。


EV作为治疗靶点


鉴于EV具有携带致瘤或神经毒性因子并在细胞之间转移这些因子的能力,抑制EV的形成、释放或摄取可能会降低囊泡介导的发病机制的负荷(图2)。是否有更多的囊泡释放发生在疾病存在是有争议的,研究团队报告没有变化,疾病中更多的释放或反之亦然。

正在探索治疗靶向EV的三种主要方法:(1)通过靶向nSMase2途径抑制EV释放,(2)通过靶向ESCRT机制的组分抑制EV释放和(3)抑制病理性EV的摄取通过受体细胞。然而,确定专门针对致病性EV与生理维持和交流所需的健康EV的化合物和方法是一项关键挑战。

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抑制EV释放


GW4869(靶向nSMase2)等药理学EV抑制剂已被用于研究抑制EV释放的效果。例如,用莫能菌素处理朊病毒感染的细胞会增加EV的释放,这与朊病毒的细胞间传播相关,并且被GW4869逆转。进行了类似的实验来研究结肠直肠癌细胞衍生的EV,它们在体内诱导结肠癌细胞的增殖和抑制细胞凋亡;用GW4869治疗后肿瘤生长受到抑制。在从表达人类突变体tau的AD小鼠模型培养的原代小胶质细胞中,GW4869或靶向nSMase2的siRNA也抑制了Tau通过小胶质细胞衍生的EV传播。

此外,在AD的5XFAD家族性小鼠模型中,GW4869与预期一样显著降低了神经酰胺水平,从而导致脑源性EV水平和血清EV分泌降低。虽然EV仍然可以从替代途径分泌,但该研究表明,对nSMase2的药理学抑制能够减少体内AD大脑中的淀粉样蛋白负荷和斑块负荷。本研究的后续研究产生了nSMase2缺陷型5XFAD小鼠,与5XFAD小鼠相比,其脑组织中神经元衍生的EV分泌显著减少。nSMase缺陷小鼠的EV分泌减少通过减少淀粉样蛋白负荷和tau磷酸化来规避AD病理学的进展,这改善了5XFAD小鼠模型的认知能力。需要更多的研究来进一步探索靶向nSMase2以减少EV释放的潜力。必须调查GW4869的潜在脱靶效应。例如,据报道,GW4869除了对nSMase2的抑制作用外,还具有脂质结合特性。此外,SMase2的细胞表达差异可能会带来额外的挑战。

Cannabidoil是一种具有抗炎和抗肿瘤活性的抗焦虑药,而氯脒是一种不可逆的pan-PAD抑制剂,已被证明可以抑制几种癌细胞的EV释放。与氯脒相比,大麻油在癌细胞中更有效地抑制100–900nm囊泡的释放。其他EV抑制剂,如细胞松弛素D、格列本脲和氯丙嗪,可减少大小大于150纳米的囊泡的释放。这些化合物通过破坏细胞骨架来抑制EV的释放,导致癌细胞对甲氨蝶呤等癌症药物的敏感性增加。大多数这些研究是使用癌细胞系进行的并且尚未在小鼠模型中得到验证。

ESCRT机制的靶向组件可用于抑制致病性EV的释放。该领域仍处于起步阶段,因为可能需要针对ESCRT机器的多个组件及其辅助蛋白。然而,据报道,在朊病毒疾病的细胞模型中敲除HRS会抑制朊病毒蛋白的释放,从而抑制感染性。沉默ESCRT-I复合物的一个成分TSG101证实了传播是通过EV分泌介导的。

癌细胞利用经典的外泌体途径来驱动肿瘤存活,一些研究已经观察到免疫抑制作用和/或通过消耗ESCRT的成分来减少肿瘤生长。ALIX负责ILV中的内容物掺入,可以敲除以改变癌细胞中释放的EV的组成。来自ALIX敲低乳腺癌细胞系的EV的蛋白质组学分析显示,与对照相比,12种蛋白质显著下调。一种特殊的蛋白质PD-LI在肿瘤相关免疫抑制中具有重要作用,它保留在MVB中,而是在ALIX敲低细胞中被募集到质膜中。这种失去ALIX后的抗肿瘤免疫反应在乳腺癌的体内小鼠模型中得到了验证。

在另一项研究中,需要用带电多泡体蛋白4B(CHMP4B)抑制ALIX二聚化,以确保显著降低EGFR等蛋白质的MVB/ILV分选。此外,通过小发夹RNA(shRNA)敲低RAB27A可减少人肺腺癌细胞中EV的分泌,这可能有助于抑制EV衍生的金属蛋白酶和与肺腺癌相关的肿瘤衍生的EV miRNA的释放和摄取,从而导致减少在原发性肿瘤生长中。

虽然工程细胞来击倒ESCRT机制可能更具体,但使用药理学抑制剂可能是一种更实用的方法。癌症药物的高通量筛选确定了替比法尼能够抑制转移性去势抵抗性前列腺癌细胞中的ESCRT依赖性Alix和ESCRT非依赖性nSMase2外泌体生物发生。在同一项研究中发现的其他抑制剂包括奈康唑、酮康唑和攀登唑,所有这些都通过抑制Alix表达来减少EV的释放。

应该指出的是,抑制内质溶酶体功能障碍是原因的神经退行性疾病中的EV释放可能导致神经毒性蛋白的积累并加速病理。例如,在唐氏综合征患者中,CD63的敲低导致内体异常,而RAB27A的沉默导致有毒蛋白TARDNA结合蛋白43(TDP43)在神经元中的积累,这是ALS的标志。Rab27a敲低也被证明表现出脱靶效应,敲除小鼠表现出中性粒细胞和血小板释放颗粒的缺陷。RAB27A细胞表达水平的差异也可能带来治疗挑战。

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阻止EV吸收


抑制EV介导疾病传播的另一种潜在方法是通过阻断EV摄取途径。然而,由于涉及的复杂性和多种机制,例如网格蛋白依赖和网格蛋白非依赖途径的内吞作用、血浆或内体膜融合、吞噬作用,EV的吸收仍在进行深入研究,并且假设不断被审查。和微胞饮作用。由于显微镜的限制,也很难确认内化和吸收程度。

然而,一些研究提供了有希望的发现。例如,一种dynamin抑制剂dynosore可通过网格蛋白介导的途径减少转铁蛋白的内化,观察到显著抑制来自EBV感染的B细胞的标记CD63+EV向EBV阴性上皮细胞的摄取和内化。此外,使用dynosore也抑制了从人类恶性黑色素瘤细胞系分泌的肿瘤衍生EV(膜联蛋白V+)的内化,进一步观察到这导致肿瘤血管生成减少。


EV作为疾病生物标志物


EV研究中一个快速增长的兴趣领域是EV作为诊断生物标志物的潜在应用。在当前基于组学的技术时代,已在从生理和疾病环境中分离出来的EV中鉴定出大量蛋白质、核酸、脂质和聚糖。尽管这些研究具有良好的预后和诊断潜力,但很少有人进入临床。EV研究人员,主要是在学术实验室内,投入了大量精力来分析潜在的EV生物标志物。


然而,大多数学术实验室在确定和确保处理生物样本的分析前程序遵循与病理学实验室认证相关的法规方面经验不足。在一个相对较新的领域满足通用标准具有挑战性,因为研究人员仍在开发在固有平台差异和验证不一致之间进行EV分离的方法。最近市场上大量商业EV分离试剂盒加强了EV生物标志物的研究,并促进了潜在EV生物标志物的临床前开发和转化(表1)。

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癌症生物标志物


从各种癌症的细胞和小鼠模型中分离出的EV已被分析和审查。然而,该领域仅通过ExosomeDiagnostics针对前列腺癌、肺癌和与癌症相关的各种突变(如EGFR/MAPK和PI3K2,169,170,171)的测试(表2)成功地将EV生物标志物转化为临床。

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与癌症相关的mRNA基因片段在血液中以高丰度循环,这些片段可能包含在EV中,因此很容易使用分子生物学方法检测到。此外,循环肿瘤DNA也可以由致瘤性凋亡细胞释放,并用于开发癌症生物标志物。ExosomeDiagnostics的成功可能是因为他们能够使用他们专门设计的EV分离试剂盒来富集这些RNA标记物,还因为他们在多个地点进行了大规模的临床验证研究,以改进他们的诊断算法。

其他致癌突变也具有用作EV RNA生物标志物的潜力。例如,在分离血浆EV后,80-85%的晚期和转移性胰腺导管腺癌患者可以检测到KRAS突变。此外,通过qPCR在患者中检测到与黑色素瘤有关的BRAFV600突变,该突变与从淋巴引流中获得的渗出性血清分离的EV中发现,灵敏度为95%。其他投资于癌症EV诊断的公司包括Exosomix、CarisLifeSciences和NXPharmaGen,它们正在开发针对与脑癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌相关的突变或单链核苷酸的EV测试。

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神经退行性疾病生物标志物


在神经退行性疾病中,大多数基于EV的检测仍处于生物技术公司或学术实验室的验证阶段。NanoSomix使用神经衍生的EV,检测到与AD相关的蛋白质的平均比率存在显著差异,例如磷酸化1型胰岛素受体底物、神经突蛋白2α(NRXN2α)、含GluA4的谷氨酸(AMPA4)受体、神经胶质素1(NLGN1)的水平、P-T181-tau、P-S396-tau和Aβ1-42在AD患者中与病例对照相比,并证明它们可用作临床前AD的血液生物标志物。

此外,一项于2016年完成的临床研究旨在测试检测磷酸化LRRK2的临床效用,LRRK2是一种与PD中观察到的病理特征相关的PD相关基因,例如α-突触核蛋白的蛋白质包涵体的积累。从具有致病性LRRK2突变的PD患者的尿液中分离出的EV中发现LRRK2显著升高。ExosomeSciences目前正在与美国各个国家橄榄球联盟合作,以验证他们基于血浆EV ELISA的检测方法,该检测方法可检测EV中的tau蛋白(TauSome),可用于诊断患者,尤其是运动员的慢性创伤性脑病。ExosomeSciences计划将TauSome检测应用于其他神经系统疾病,如AD。

除了基于蛋白质的检测外,还有各种有前途的EV血液检测方法,它们在检测与AD和PD相关的EV miRNA方面表现出高灵敏度和特异性。例如,发现一组16种miRNA在AD患者的血清EV中失调,这与脑成像、神经心理测量测试和APOEɛ4基因分型等其他诊断方法相关,并提供了87%的敏感性和77%的特异性在他们的验证研究中预测AD。

一项后续研究表明,这些miRNA生物标志物中的一些也存在于从AD患者死后大脑中分离的额叶皮层衍生的EV中。这些发现表明,如果可以确定与疾病病理学有关的EV内容物,则从外围分离EV可以深入了解大脑的退化程度。类似的研究确定了与AD相关的其他EV miRNA面板,具有相似的准确性。这些研究证明了使用EV miRNA作为与其他生物标志物的补充工具作为AD预筛选的潜在可行性。但是,我们还没有看到这些诊断测试是否会进入临床。


EV的治疗应用


EV的生物学功能使其适合开发为几种情况的潜在治疗剂(图3)。

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图3. 治疗性靶向EV及其产生方法。

这是目前一个非常活跃的研究领域,学术团体和公司正在研究使用天然EV制剂(例如由细胞直接分泌的制剂)、将内容物分子装载到EV中的潜力以及仿生囊泡的使用(表3)。

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这些方法中的每一种都有其自身的挑战,这反映了EV表征和操作的技术能力。此外,目前还没有明确的EV疗法监管框架,尽管它们可能属于生物制品的药物类别。一种治疗药物要获得临床批准,需要证明其药代动力学和治疗功效,而这些目前在EV领域还处于起步阶段。

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原生EV准备工作


几项体内研究表明,各种来源的EV具有治疗潜力。这些包括间充质干细胞、树突状细胞、源自血浆的EV和仿生纳米囊泡。心脏球衍生细胞也是用于治疗心血管疾病的EV的来源,目前CapricorTherapeutics正在进行I期临床试验。

1)MSC衍生的EV

MSC可以来自多种来源,包括脐带血、骨髓、牙髓和脂肪组织。使用MSC进行了许多临床试验,并且MSC已被证明在细胞治疗方法中具有良好的耐受性,但人们认为观察到的MSC的治疗效果来自分泌因子,而不是细胞本身。这导致人们非常关注使用源自MSC的EV作为潜在的治疗剂。MSC衍生的EV已用于多种疾病模型,主要是因为它们具有免疫调节潜力。MSC衍生的EV的应用可能会克服与使用这些细胞相关的一些安全问题,因为它们不能形成肿瘤,尽管这种潜力尚未得到很好的表征。

MSC衍生的EV已在心肌缺血/再灌注损伤、中风和乳腺癌模型中显示出疗效。在心肌梗塞模型中,MSC衍生的EV减少了梗塞的大小和细胞凋亡分子标志物的诱导。随后的研究表明,MSC衍生的EV的心脏保护作用可以通过miR-22和miR-221等miRNA的作用来介导,这表明囊泡的RNA内容物可能对治疗作用很重要。同样,含有miR-133b的MSC衍生的EV改善了中风大鼠模型的恢复。此外,MSC衍生的EV在小鼠局灶性脑缺血模型中的应用表现出积极作用,增加了血管神经生成,从而产生了长期的神经保护作用。MSC衍生的EV显示出与MSC细胞相似的功效。

使用MSC衍生的EV进行的人体研究包括治疗一名患有移植物抗宿主病的患者,没有发现明显的副作用,并且症状在几个月内有所下降。通过测量血液中促炎和抗炎细胞因子水平来监测治疗,观察到几种促炎细胞因子(包括IL-6、IL-8和IL-17)的水平显著降低。慢性肾病是另一种人类疾病,已在人体中进行了试验。源自脐带组织MSC的EV用于治疗患有长期慢性肾病的患者。在治疗组中观察到症状有所改善,抗炎细胞因子水平降低,在治疗后12个月进行测试时效果持续存在。

2)DC衍生的EV

使用源自DC的EV也显示出治疗前景,并且由于它们的免疫调节功能有可能针对多种疾病。DC衍生的EV可用于(通过刺激免疫系统的EV)接种结核病和弓形虫感染等传染病。使用这种方法类似地测试了在分枝杆菌外膜囊泡中释放的其他分枝杆菌抗原。已开发出多种外膜囊泡疫苗,并成功获得了针对脑膜炎双球菌血清群B(导致脑膜炎球菌疾病)的许可,例如VA-MENGOC-BC、MenBvac、MeNZB和Bexsero,这些疫苗在儿童中和成年人的有效性超过70%。这些疫苗为预防金黄色葡萄球菌等其他主要分枝杆菌感染提供了希望。

S. aureus释放含有毒力因子(如肠毒素、IgG结合蛋白和溶血素)的EV,发现EV在骨髓来源的DC中引发免疫原性反应,并在S. aureusEV免疫的小鼠中诱导保护性免疫。此外,感染登革热病毒的单核细胞衍生的DC释放含有与免疫反应相关的mRNA和miRNA的EV,以及可用于开发疫苗的病毒颗粒。

DC衍生的EV(有时称为“dexosomes”)也已作为潜在的抗癌疫苗进行了研究,并且大量正在进行临床试验。这种方法利用了DC衍生EV的分子特性,因为它们含有DC上存在的免疫刺激因子,并且可以通过位于囊泡外部的肽-MHC复合物呈递抗原。迄今为止,大多数已完成的临床研究报告了对癌症患者的合理安全性,并具有轻度至中度的副作用,例如流感样症状。与MSC衍生的EV一样,这些囊泡的使用降低了与细胞疗法相关的风险,包括促肿瘤活动。DC衍生的EV来源于单核细胞衍生的DC的自体培养。

迄今为止,大多数已完成的临床研究都显示出适度的反应,例如低水平的T细胞反应,与NK细胞刺激有关。一项临床试验为转移性黑色素瘤患者接种了含有MHCII类肽的DC衍生EV,这在一名患者的肿瘤区域募集了激活的T细胞反应,而试验中的其余患者显示出最小的反应。在非小细胞肺癌患者的另一项I期试验中也观察到了类似的适度反应,其中四分之二的患者表现出NK活性。这些发现表明,可能需要对DC衍生的EV进行设计或操作,以提高其引发所需免疫反应的能力。

先天免疫反应的一个关键机制是干扰素基因刺激物(STING)通路,它可以产生肿瘤特异性T细胞反应。含有STING通路激动剂的工程EV正在探索作为一种潜在的抗癌疗法,目前正处于I期临床试验(CodiakBiosciences)。

3)血浆衍生的EV

源自血浆的EV也被用作潜在的治疗剂,特别是用于再生应用。富含血小板的血浆,浓度高于生理学在全血中发现的浓度,并且是用于这些治疗的EV的来源。从富含血小板的血浆中分离出的EV富含由其来源的血小板产生的生长因子(如血小板衍生生长因子、转化生长因子-β和血管内皮生长因子)。

初步研究表明,从血小板裂解物中分离的EV以剂量依赖性方式增加了骨髓来源的MSC的增殖和迁移特性,将血小板裂解物中所见的影响归因于这些制剂中包含的EV。一项研究糖尿病啮齿动物模型伤口愈合的研究证实了源自富含血小板的血浆的EV具有由囊泡中所含生长因子介导的增殖和迁移效应的进一步证据。此处证明,使用源自富含血小板血浆的EV治疗的伤口愈合速度明显快于未治疗或使用富含血小板血浆本身治疗的伤口。

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内容物运送


使用EV作为治疗剂的优点之一是它们在自体使用时表现出低水平的免疫原性,从而限制了潜在的副作用。它们的大小和脂质膜成分使它们成为与靶细胞融合的理想选择,它们可以在其中运送内容物,同时避免降解。它们还具有优于固有毒性的合成纳米颗粒(例如脂质体)的优势。这些特性导致开发了向EV装载治疗性内容物以治疗多种疾病的方法。将内容物装载到EV中的方法包括操纵原始细胞以过度表达特定的内容物,使用电穿孔物理掺入小功能RNA,或对细胞本身进行化学处理。

通常情况下,miRNA和siRNA已被加载到EV中,其中可以使用基于荧光素酶基因表达的测定来验证是否传递到受体细胞中。从血浆中本地生产的EV也可以被修改以包含治疗性内容物。这方面的一个例子是使用电穿孔将治疗性抗肿瘤miRNA掺入从人血浆中分离的EV中,然后显示其促进人肿瘤细胞系的凋亡。比miRNA和siRNA大的核酸(如线性DNA)可以通过电穿孔以每个囊泡数百个分子的数量加载。然而,已观察到线性DNA的限制约为750–1,000个碱基对或质粒DNA分子范围为4.5kb至10kb,增加长度的效率较低。必须控制的另一个挑战是发现电穿孔会导致核酸聚集体的产生,从而降低吸收效率和装载内容物的影响。

操纵亲代细胞过度表达治疗性内容物是装载小型EV的常用方法。这种方法在很大程度上依赖于确保感兴趣的内容物通过外泌体生物发生途径装载到EV中。使用模拟物过度表达miRNA是一种常见的方法,它会导致EV分泌额外的外源miRNA。例如,过表达miR-146a的DC产生富含miR-146a的EV,这些EV在重症肌无力小鼠模型中具有抗炎作用并降低CD80和CD86水平。此外,过表达miR-146b的骨髓基质细胞分泌的含有miR-146b的EV能够减少原发性脑肿瘤大鼠模型中胶质瘤异种移植物的生长。然而,其他研究表明,其他miRNA,如miR-124、miR-145和miR-454-3p,也可以抑制神经胶质瘤细胞。文献中观察到对一种特定癌症具有抗肿瘤作用的miRNA的数量对其对疾病的特异性产生了不确定性;这个问题不仅限于癌症,而是涉及所有情况。

使用纳米技术将EV靶向特定组织以获得方向控制也已被用于整合RNA适体,附着在噬菌体phi29马达包装RNA上,该RNA显示在EV表面,作为与癌症过度表达的特定受体结合的配体细胞。与神经元特异性RVG肽融合的溶酶体相关膜糖蛋白2(LAMP2)等表面分子的表达已成功用于在AD小鼠模型中将含有siRNA内容物的EV递送至大脑。含有针对致癌Kras的siRNA的EV也已被设计并显示可抑制小鼠的胰腺癌。EV也可用于递送mRNA内容物,例如HChrR6基因,该基因编码一种人源化大肠杆菌酶,该酶参与转化导致DNA嵌入的细胞毒性药物。用编码HChrR6的mRNA转染各种细胞系被证明具有积极作用,例如几乎完全阻止乳腺癌异种移植物上的肿瘤生长。

在表达KrasG12D的人胰腺原位肿瘤小鼠模型中,从MSC分泌并用对致癌突变KRASG12D特异的siRNA(称为iExosomes)进行电穿孔的EV(CD9+、CD63+和CD81+)的临床级生产将肿瘤生长抑制到几乎无法检测到的水平。其他方法包括将LAMP2与神经元特异性RVG肽融合在一起的EV工程,以实现跨BBB的转移并靶向神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞,这些神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞可以装载内容物以靶向AD。还表明,心脏球衍生的EV具有促进心肌细胞存活和增殖的血管生成特性,这是一种正在开发的方法来再生受伤的心肌。

其他使用改良EV作为治疗方法的方法包括使用含有腺相关病毒载体的EV向耳蜗毛细胞提供基因治疗解决方案,以治疗听力障碍。EV也可以被设计来传递目标蛋白。NDFIP1被确定为参与将蛋白质加载到EV中,这是通过用NDFIP1识别的WW标签标记目标蛋白来利用的,从而将目标蛋白加载到EV中。第一个用作证明原理的蛋白质是Cre重组酶,一旦被受体细胞内化,它也被用作报告蛋白。WW-CreEV的鼻腔给药导致整个大脑细胞的正摄取,这表明这些工程化的EV可能对神经系统疾病有用。其他人将肿瘤相关抗原融合到乳粘素的C1C2结构域,这是一种脂质结合结构域,可将乳粘素募集到EV。

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仿生囊泡


除了细胞衍生的EV外,其他纳米粒子也具有作为治疗剂的潜力,包括仿生囊泡、脂质体、碳纳米管、胶束和树枝状大分子等实体。细胞衍生的仿生囊泡可以使用诸如通过特定孔径过滤器的连续挤出等技术生产。通过这种方式形成的囊泡已被证明与EV具有相似的特性,具有相似的特征,包括它们的大小和膜组成。几项研究表明,与小型EV相比,功能性模拟EV可以从不同的亲代细胞产生100多倍以上的颗粒产量。通过这些方法产生模拟EV的原理是基于细胞膜中存在碎片脂质,这些脂质可以重新组装形成球形结构并同时封装周围的分子。

模拟EV的生产涉及三个主要步骤:收获细胞并在合适的缓冲液中重新悬浮、通过机械力破坏细胞以及纯化/富集产生的囊泡。这种生产方法的优势包括更大规模的生产和在合成过程中将治疗分子掺入囊泡中的潜力。这方面的一个例子是将化学治疗剂掺入仿生囊泡中,该囊泡在小鼠全身给药后可以有效对抗恶性肿瘤。迄今为止,仿生囊泡主要保存在学术研究实验室中,并没有被公司用于开发治疗方法。然而,合成纳米囊泡(如脂质体)长期以来一直被用于递送阿霉素等药物以靶向癌症。



挑战和未来方向


尽管EV的治疗和诊断应用对几种人类疾病具有很大的前景,但也存在一些相关的挑战。
技术挑战代表了一个重大问题——从分离方法到临床适用的EV制剂的表征和标准化。EV及其亚型的分离通常依赖于使用低通量技术,例如超速离心。采用切向流过滤或尺寸排阻色谱等方法的较新方法显示出能够从大量培养基中制备EV的前景。扩大细胞培养以生产足够的EV用于临床应用也是一项重大的技术挑战。随之而来的是与使用生物反应器和使用培养基补充剂(如胎牛血清)相关的问题,胎牛血清本身就含有EV,这证明了表征作为扩大生产的一部分的重要性。

分离产品的全面表征需要标准化,特别是必须定义EV在制剂中的功能活动。确定治疗性EV的有效剂量甚至作用机制,特别是那些来自干细胞来源的EV,仍然是该领域面临的挑战。更深入地了解特定EV制剂的作用方式将有助于开发适当的剂量和功能评估。一旦定义了这些参数,这可以通过增加我们对EV异质性范围的理解和改进分离协议以丰富具有最大功能活性的囊泡来帮助。开发可以测量特定EV群体功效的效力测定是另一个挑战。将特定的生物活性归因于EV以用作治疗效力的标记是可能有助于解决此问题的一种方法。此类检测的开发对于EV疗法的监管批准非常重要。

关于EV作为药物输送剂的应用,一个应该探讨的问题是装载外源性内容物是否会干扰内源性内容物或与内源性内容物相互作用,以及这是否会产生与脱靶效应相关的问题。如果脱靶效应超过治疗目标,EV的异质性可能会成为一个重大障碍,尤其是在癌症等多方面疾病中。例如,几乎可以肯定的是,在EV中传递一种miRNA不会完全解决疾病,可能需要一个miRNA家族来确保下游和上游靶标也在受体细胞中受到调节。就基于核酸负载的EV疗法而言,有几个关于功能性RNA递送机制的考虑。

另一个问题是确定用于EV分离和治疗用途的最安全的细胞来源,以避免免疫原性问题并确保EV不会传递不需要的有毒内容物。为了解决这些问题,必须建立适当的临床前模型,并选择具有所需内容物和分子属性的EV制剂。同样,更深入地了解特定EV制剂在治疗环境中的作用机制将指导这些参数的选择。

将EV定位到它们将进行治疗活动的部位是另一个需要进一步研究的方面。加深对EV传递机制的了解将在实现这一目标中发挥作用,并且方法将需要平衡EV的自然加工和降解与将治疗有效载荷定位到所需部位。在为针对特定位点的EV设计治疗策略时,最大限度地减少脱靶效应也是一个关键考虑因素。

虽然已经证明了具有增强特定细胞类型的趋向性或能够通过BBB传递到大脑等器官的特性的工程EV,但它们的进一步发展可能会受到生产治疗相关数量的这些囊泡的技术挑战的阻碍。使用与EV外部缀合的小抗体(纳米抗体)片段或RNA适体的最新进展表明,在将治疗性EV靶向特定位点方面具有一定的特异性。

基于EV的生物标志物的开发——无论是基于蛋白质、核酸、脂质还是聚糖——都显示出巨大的希望,特别是对于癌症和神经系统疾病等疾病。然而,将基于EV的疾病生物标志物的发现转化为临床需要技术进步,特别是对于高通量检测的开发。例如,开发能够以高通量方式从许多样品中快速分离EV的方法将增强基于EV的诊断的使用。跨实验室方法的标准化也是必不可少的,并且在不同实验室和不同样本组中对EV疾病生物标志物进行交叉验证,将加速基于实验室的研究结果向临床的转化。


展望



尽管挑战不断,但近年来EV研究领域取得了重大进展。少数基于EV的生物标志物现在用于临床或研究目的(表2)。此外,越来越多的临床前研究证明了基于EV的疗法在许多重大疾病中的潜力,这为EV疗法的临床开发奠定了基础,其中少数处于早期开发阶段(表3)。进一步的发展将需要扩大生产的技术进步,并获得相关的临床使用监管批准。尽管这些技术和监管障碍仍有待解决,但最近对EV生理和病理作用的理解迅速增长,揭示了许多潜在的诊断和治疗应用,推动了其巨大临床潜力的实现。


参考文献:

Cheng, L., Hill, A.F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nat Rev Drug Discov (2022). https://doi.org/10.1038/s41573-022-00410-w.


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